DFG-Graduiertenkolleg

Graduiertenkolleg 886 Sprecher: Prof. Dr. Norbert Gretz

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	Analyse der Chromatinkonformation durch Rasterkraftmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie PD Dr. K. Rippe, Kirchhoff-Institut für Physik (KIP), Universität Heidelberg Die eukaryotische DNA wird im Zellkern durch Histon-Proteine zu einer Kette von Nukleosomen strukturiert, in der jeweils etwa 146 Basenpaare DNA um ein Histon-Oktamer gewunden sind. Die Nukleosomen-Kette kompaktiert zu einer Fiber von etwa 30 nm Durchmesser . Lokale Eigenschaften der Chromatinfiber sowie ihre dreidimensionale Organisation haben einen großen Einfluß auf Genexpression, Replikation, DNA-Reparatur und Rekombination . Zu den Faktoren, die bestimmen, ob Chromatin in einem transkriptionsaktiven Zustand vorliegt, gehört die reversible (De)Acetylierung der Histone durch spezifische Acetylasen (HAT) und Deacetylasen (HDAC) sowie die DNA-Methylierung an der 5'-Position von Cytosin innerhalb von CpG Dinukleotiden . Die HAT/HDAC-Aktivität kontrolliert die Expression vieler Gene, und Störungen des Acetylierung-/ Deacetylierungsgleichgewichts hängen mit verschiedenen Krebsformen zusammen . Wir haben begonnen ein in vitro System zu etablieren, das aus Chromatinfibern besteht, die mit rekombinanten Proteinen und definierten DNA-Sequenzen hergestellt werden. An diesen Fibern soll der Einfluß verschiedener Proteinfaktoren (HAT, HDAC, Verbindungshiston H1, HMGN-Proteine, Chromatin-Remodellierungs-Faktoren, etc.) auf die Konformation der Fiber untersucht werden. Außerdem ist beabsichtigt, Änderungen der Chromatinkonformation in vivo mit Fluoreszenzmikroskopie-Techniken in Zellkulturen zu untersuchen, in denen Fusionsproteine von autofluoreszierenden Proteindomänen mit Histonen und/oder anderen Proteinen stabil exprimiert werden. Ziel dieser Arbeiten ist es, die Transkriptionsregulation durch Änderungen der Chromatinkonformation in einem interdisziplinären Ansatz zu untersuchen, der Biophysik, Molekularbiologie und Zellbiologie kombiniert.
	Genexpressionsnanoskopie auf tumorrelevanten Genen der Prostata Prof. Dr. C. Cremer, Kirchhoff-Institut für Physik, Universität Heidelberg, Heidelberg Die im Rahmen des DFG-Schwerpunktes geplanten Untersuchungen zur Struktur von aktiven/inaktiven Genabschnitten sollen hier am Beispiel des Specific Granule Protein (SGP 28 kDa) im Prostatakarzinom thematisiert werden. Die mittlere Kompaktierung transkriptionsaktiver/-inaktiver Stadien dieses Gens soll über Größenmessungen bestimmt werden. Kürzlich durchgeführte Untersuchungen des Dekondensationsverhaltens repetitiver Gene (200 Kopien) bei Tetracyclin-induzierter Aktivierung menschlicher Zellen im Labor von David Spector (Cold Spring Harbor, nicht publiziert) haben gezeigt, dass eine erhebliche Dekondensation stattfindet. Bezogen auf ein einzelnes Gen kann aus den Daten abgeschätzt werden, dass die dekondensierte Region eines einzelnen Gens einen Durchmesser im Bereich von 100 nm hat. Eigene Analysen (nicht publiziert) des Volumens von Chromosomenterritorien mit hoher und niedriger Gendichte in menschlichen Zellkernen sind hiermit kompatibel. Dazu soll eine vor kurzem entwickelte Methode der FISH mit Oligonukleotid-Sonden auf Gewebeschnitte erweitert werden. Hierzu stehen gesundes und tumorrelevantes Prostatagewebe zur Verfügung. Mittels der SPDM-CLSM-Mikroskopie (Spektrale-Präzisions-Distanz-Mikroskopie- und Confokale-Laser-Scanning-Mikroskopie) und der SMI(Spa-tially-Modulated-Illumination)-Nanosizing Mikroskopie werden multispektral markierte Genabschnitte auf Abstände und Größen hin untersucht. Damit können erstmals unterschiedliche Kompaktierungsgrade einzelner Gene in Abhängigkeit von der Genaktivität charakterisiert werden. Diese Methode stellt eine zusätzliche Möglichkeit dar, um die Expression solcher Gene in Gewebeschnitten zu beobachten und deren aberranten Status zu charakterisieren. Hierfür soll die in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Methode der Fast-Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (Fast-FISH) weiterentwickelt werden. Diese Methode erlaubt die Hybridisierung markierter Sonden ohne Formamid oder anderen denaturierenden chemischen Agentien. Die Erweiterung der Fast-FISH Methode mit Oligonukleotiden (Oligo-Fast-Fish) verwendet mehrere kleine, mit Fluorochromen markierte Oligonukleotide einer bestimmten Gensequenz, welche auf dem Gen der Wahl kolokalisieren. Die Ermittlung des Kompaktierungsgrades erfolgt dann mittels der SMI-Nanosizing Methode.
	Differentielle und Kompartiment-spezifische mRNA-Expressionsanalyse in Präcancerosen und Carcinomen der Prostata Prof. Dr. H.-J. Gröne, Dr. M. Kenzelmann, Cellular and Molecular Pathology, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg Die invasive histopathologische Beurteilung des Prostatakarzinoms ist bisher die entscheidende diagnostische Maßnahme in der Klinik. Da histologischer und cytologischer Differenzierungsgrad und Stadium eines Karzinoms nur bedingt das biologische Verhalten eines Prostatakarzinoms widerspiegeln, ist es sinnvoll, nach zusätzlichen Markern zu suchen (Forster et al. 1994, Gleason et al. 1977, Stamney et al. 1999, Keetch et al. 1995). Unsere eigene Studie zum Transkriptom in Prostatatumoren hat Expressionsprofile von mRNA (Affymetrix Chip-System) beschrieben, die eindeutig zwischen normalem Gewebe und Tumorgewebe unterscheiden können (Ernst 2002). Erstmals wurde eine Kombination von Laser-gestützer Mikrodissektion von einzelnen Tumorzellen mit einer neuen Amplifikationsmethode von Nanogramm-Mengen von Gesamt-RNA beschrieben (Kenzelmann et al, 1999, Kenzelmann et al., - Manuskript eingereicht). Dieser neue Ansatz identifizierte bisher unbekannte mRNA, die für Markerproteine in Tumorepithel- und Tumorstromazellen kodieren; Tumorepithelien und Stromazellen in unmittelbarer Nähe von Tumorepithelien wiesen differentielle Veränderungen des Expressionsmusters auf, die vermutlich tumorrelevante Interaktionen zwischen Epithel und Stroma widerspiegeln (Matsumoto 1996, Olumi 1999). Unsere Transkriptom-Untersuchungen an Prostata und Niere zeigten jedoch auch, dass zwischen dem Transkriptom und dem Proteom eine geringe qualitative und quantitative Übereinstimmung besteht (Ernst et al. 2002, Cohen et al. 2002, Gröne et al. 2002, Heiske et al. 1999, Kenzelmann et al, 2000, Kretzler et al. 2002). Nur ein Teil der polyA-haltigen mRNA, die bei Transkriptomanalysen erfasst werden, wird auch tatsächlich in das Zytoplasma transportiert und dort in Proteine translatiert (Moore et al 2002). Ein Ziel der Untersuchungen ist es, mRNA in verschiedene, Zellkompartiment- und Translations-abhängige Fraktionen zu separieren und entsprechende Expressionsprofile zu erstellen. Ein weiteres Ziel wird sein, verschiedene Präcancerosen und Carcinom-Differenzierungen auf mRNA-Expressionsmuster zu analysieren, um Hinweise zur Carcinogenese und diagnostische Markerprofile zu erlangen.
	Molekulare Charakterisierung definierter Tumorgruppen mittels DNA-Microarray-Techniken Prof. Dr. P. Lichter, PD Dr. S. Joos, Dr. M. Hahn, Dr. B. Radlwimmer, Molekulare Genetik, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg Tumorerkrankungen stellen genetische Erkrankungen dar, die sich ursächlich auf unterschiedliche molekulare Veränderungen des Genoms zurückführen lassen. Dies geht einher mit Veränderungen im Genom, Transkriptom und Proteom der Tumorzellen. Zur umfassenden molekularen Charakterisierung von Tumoren haben sich verschiedene Microarray-Techniken [Wilgenbus and Lichter, 1999], wie z.B. cDNA-Microarrays, bewährt, mit deren Hilfe das Gen-Expressionsmuster von mehreren tausend bis zehntausend Genen im parallelen Ansatz durch Analyse des mRNA-Pools einer spezifischen Tumor-Probe im Vergleich zu einer Kontrollgewebeprobe untersucht werden kann [Stratowa et al., 2001; Fritz et al., 2002]. Neben cDNA-Microarrays können auch Arrays verwendet werden, die mit genomischen DNA-Klonen bestückt sind. Nach Hybridisierung solcher Microarrays mit differentiell markierter Tumor-DNA und DNA aus normalen Zellen gelingt es, Veränderungen in der Kopienzahl pathogenetisch relevanter Genregionen in Tumorzellen zu bestimmen. Diese Technik wird als Matrix-CGH bezeichnet [Solinas-Toldo et al., 1997]. Die Ergebnisse geben nicht nur Aufschluß über die Pathomechanismen in Tumoren, sondern können auch zur detaillierten Subklassifikation herangezogen werden [Wessendorf et al., 2002; Fritz et al., 2002].
	Gleichzeitige Analyse von Expressionsveränderungen und 'Splice'-Variationen in Krebs Dr. J. Hoheisel, Funktionelle Genomanalyse, Deutsches Krebsforschungszentrum Mittlerweile ist aus der Sequenzierung des menschlichen Genoms klar geworden, dass die Gesamtzahl an kodierenden Bereichen mit etwa 30.000 bis 40.000 Genen beträchtlich unter dem erwarteten Wert liegt. Damit steht zu erwarten, dass die Regulation zellulärer Funktionen, soweit sie auf RNA-Ebene geschieht, neben der Variation der Transkriptmenge (‘Diffential Transcription’) auch nicht unwesentlich über die Reifung der RNA (‘Differential Splicing’) erfolgt. Eine gleichzeitige Analyse beider Faktoren ist Voraussetzung für ein Verständnis der Regulationsvorgänge, die sich auf RNA-Ebene abspielen. Alle gegenwärtig zugängliche menschliche Sequenzinformation ist bisher nur vorläufig annotiert. Es wird mit großer Sicherheit eine relativ große Zahl an Exons geben, die in dieser ersten Annotationsrunde nicht als solche erkannt werden bzw. falsch als Exon definiert wurden. Selbst bei der Analyse der Sequenz der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurden, trotz einer wesentlich einfacheren Sequenzstruktur, mehrere Hundert ORFs falsch annotiert. Aufgrund der weit höheren Komplexität des menschlichen Genoms allgemein und der Genstruktur im Speziellen ist mit einer wesentlich höheren Fehlerrate zu rechnen. Transkriptionelle Untersuchungen auf Microarrays werden zur Zeit hauptsächlich auf Glasträgern durchgeführt, auf die entweder kurze Oligonukleotide [Lipshutz et al., 1999] oder PCR-Produkte [Schena et al., 1995] aufgebracht wurden. Oligonukleotid-Chips sind für Forschungsarbeiten bislang sehr kostenintensiv und selten flexibel. Mit PCR-Produkten lassen sich generell keine Exon-spezifischen Analysen durchführen. Seit kürzerer Zeit werden auch längere Oligonukleotide (30-mere bis 60-mere) in situ hergestellt und zur empirischen Annotation des Humangenoms herangezogen [Hughes et al., 2001], allerdings wiederum von einem zentralen Hersteller, was die Flexibilität wesentlich verringert. Generell sind alle diese Analysen abhängig von der Qualität der Sequenz in den verfügbaren Datenbanken und deren Annotation, da diese für die Auswahl der Oligomere bzw. cDNA-Cluster genutzt wird. In einer bestehenden Kooperation wurde mit der Geniom® Technologie der Firma febit (Mannheim) eine neue Plattform für die breite Palette der DNA-Array-Anwendungen entwickelt. Diese Technologie ermöglicht es, ausgehend von digitalen Gensequenzdaten, die auf individuelle Anwendungen zugeschnittenen Arrays innerhalb weniger Stunden vor Ort selbst herzustellen. Die als Reaktionsträger für die Array-Synthese und Hybridisierung verwendete dreidimensionale Mikrostruktur lässt sich durch ihre Bauform zugleich auch als Reaktionskammer für ‚On-Chip‘-Polymerasereaktionen verwenden. Dies ist wichtige Voraussetzung für die Weiterentwicklung der Anwendung von Microarrays. In der Abteilung Funktionelle Genomanalyse des DKFZ wurde wiederum eine Chemie entwickelt, die es erlaubt, lichtgesteuerte in-situ-Synthese von Oligonukleotiden mit sehr hoher Ausbeute (>98% je Kondensation) durchzuführen [Beier et al., 2000]. Gleichzeitig kann die chemische Syntheserichtung umgekehrt und damit derjenigen biologischer Systeme angeglichen werden. Die chip-gebundenen Oligomere sind folglich nach der Synthese über ihr 5‘-Ende am Träger fixiert und besitzen ein freies 3‘-Ende, das als Substrat für eine Verlängerung durch eine Polymerase dienen kann [Beier et al., 2001]. Komplementär zur Analyse mit DNA-Microarrays sind mittlerweile Untersuchungen der tatsächlichen Proteinexpression mittels Antikörper-Microarrays möglich geworden. Diese Technik steckt zwar noch in den Kinderschuhen und wird bis zu einer routinemäßigen Anwendung Einiges an technologischer Entwicklungsarbeit erfordern [z.B. Kusnezov et al., 2002], produziert aber bereits jetzt erste Ergebnisse. Gleichzeitig wurde in der Abteilung Funktionelle Genomanalyse ein zum Patent angemeldetes Verfahren entwickelt, das erlaubt, Unterschiede zwischen Proteinpopulationen zu identifizieren und isolieren. Auch dieses Verfahren befindet sich noch in der Entwicklungsphase, die durch ein vorläufig bewilligtes BMBF-Projekt finanziert wird. In Kombination werden diese Techniken eine Möglichkeit bieten, Variationen in der Expression und RNA-Reifung auf der Proteinebene zu komplementieren.
	Molekulare Charakterisierung mikrobieller Synthesewege mit Hilfe der DNA-Array-Technologie Prof. Dr. M. Mack, Institut für technische Mikrobiologie, Fachhochschule Mannheim - Hochschule für Technik und Gestaltung Naturstoffe d. h. chemische Verbindungen, die man aus Mikroorganismen isolieren kann, repräsentieren eine reiche Quelle an biologisch aktiven Verbindungen. Bioaktive Substanzen beeinflussen Lebensfunktionen schon in sehr geringen Konzentrationen - sie wirken effektiv und oft auch sehr spezifisch z. B. auf bestimmte Proteine. Wegen dieser Spezifität eignen sie sich für die Anwendung in vielen Bereichen der biologischen Forschung und können zudem Leitstrukturen für die Entwicklung neuer Pharmaka liefern (1). Naturstoffe hatten einen bedeutenden Anteil an der Erforschung und Entwicklung neuer Arzneimittel sowie Pflanzenschutzprodukte, was sich aus der retrospektiven Analyse wichtiger Handelsprodukte leicht ableiten lässt. Nur ca. 0.1 % der vorhandenen Mikroorganismen konnten bisher isoliert und beschrieben werden. Viele akademische und industrielle Forschungsprogramme beschäftigen sich daher mit der Anreicherung und Isolierung dieser nur mit dem Lichtmikroskop sichtbaren Lebewesen. Das Fernziel dieser Projekte ist die Isolierung neuer bioaktiver Substanzen. In zentralen Stammsammlungen sind durch diese Projekte eine Vielzahl von Stämmen hinterlegt, die biologisch interessante Wirkstoffe synthetisieren. Für eine Analyse dieser Wirkstoffe bzw. für deren wirtschaftliche Verwertung ist es notwendig, diese in großem Maßstab zu produzieren. Für die meisten Naturstoffe bietet sich ein biotechnologischer Produktionsprozess an. Ausgereifte biotechnologische Prozesse haben diverse Vorteile. Sie sind oft kostengünstiger, basieren auf nachwachsenden Rohstoffen und liefern in vielen Fällen naturidentische und damit wirksamere Verbindungen. Die biochemischen und molekularbiologischen Grundlagen der Wirkstoffsynthese d. h. die verantwortlichen Enzyme, Gene und Regulationsmechanismen sind Voraussetzung für die Entwicklung eines kompetitiven biotechnologischen Produktionsprozesses. Die meisten hinterlegten Stämme sind jedoch in dieser Beziehung noch nicht ausreichend charakterisiert. Prokaryontische Mikroorganismen enthalten insgesamt ca. 4000-8000 verschiedene Gene. An einer Wirkstoffsynthese sind beispielsweise 15-30 Gene direkt bzw. weitere 15 Gene indirekt beteiligt. Die Charakterisierung dieser Gene mit herkömmlichen Methoden ist sehr aufwendig, vor allem dann, wenn ein neuer, molekularbiologisch kaum charakterisierter Organismus, untersucht werden soll. Um den Zeitbedarf für eine biotechnologische Prozessentwicklung so kurz wie möglich zu halten, eignet sich die DNA-Array-Technologie in hervorragender Weise. Diese Technologie erlaubt es, die Aktivität aller Gene einer Zelle in einer bestimmten Wachstumsphase gleichzeitig zu erfassen (2-7). Das Verfahren liefert ein komplettes Bild der aktiven und nicht aktiven Gene und erlaubt die schnelle Beschreibung der Physiologie von Mikroorganismen. Die für eine Wirkstoffsynthese wichtigen Gene können mit Hilfe weniger Experimente identifiziert werden. Am Institut für Technische Mikrobiologie werden zur Zeit Versuche zur Aufklärung der Roseoflavin-Biosynthese aus Streptomyces davawensis durchgeführt. Roseoflavin ist ein Antibiotikum, das strukturell dem Vitamin B2 sehr ähnlich ist (8). Der Syntheseweg für Roseoflavin wurde bisher molekularbiologisch nicht untersucht d. h. die beteiligten Gene und Enzyme sind unbekannt (9). Die Anzucht von Streptomyces davawensis ist schwierig, konnte aber in unserem Labor etabliert werden. Die Produktion von Roseoflavin wurde in der stationären Phase nachgewiesen. Ziel der laufenden Arbeiten ist es, molekularbiologische Methoden für diesen faszinierenden Streptomyceten zu entwickeln. Im Anschluß daran sollen DNA-Arrays hergestellt und Protokolle für die Hybridisierung und Datenanalyse entwickelt werden. Das Roseoflavin-Projekt soll in einer "Proof-of-concept"-Studie die Verwendbarkeit von bildgebenden Verfahren wie die DNA-Array Technologie für die Aufklärung von mikrobiellen Stoffwechselwegen testen. Falls sich das Verfahren eignet, können auf diese Weise Stoffwechselwege anderer relevanter Organismen rasch analysiert werden. Der Bedarf, vor allem im Hinblick auf die wirtschaftliche Verwertung von neuen pharmazeutischen Wirkstoffen, erscheint sehr groß.
	Molekulare Charakterisierung der vaskulären Erbkrankheit Hereditäre Hämorrhagische Teleangiektasie mittels DNA-Microarray-Techniken und FRET-Mikroskopie Prof. Dr. P. Kioschis, Dr. A. Lux, Prof. Dr. M. Hafner, Institut für Molekularbiologie und Zellkulturtechnik, Fachhochschule Mannheim - Hochschule für Technik und Gestaltung Hereditäre Hämorrhagische Teleangiektasie (HHT) ist eine autosomal dominante Erbkrankheit, die in der Literatur auch als Morbus Osler, Osler-Rendú-Weber oder Rendú-Osler-Weber Syndrom bezeichnet wird. Es handelt sich hierbei um vaskuläre Dysplasien, die durch Teleangiektasien und arteriovenöse Fehlbildungen der Haut, Mukosa und Viscera gekennzeichnet sind. Hiervon betroffen sind verschiedene Organe wie Lunge, Leber, Gastro-Intestinal Trakt, ZNS. HHT zeigt eine weltweite Verbreitung, mit einer Mortalitätsrate von ca. 10%. Untersuchungen in den letzten 10 Jahren deuten daraufhin, dass die Inzidenz bei 1:10.000 liegt, aufgrund neuerer Daten ist sie wahrscheinlich sogar noch häufiger (IV. Intern. HHT Konferenz, Tenerifa, April 2001). Mutationen in einem von zwei Genen, Endoglin bzw. ALK1 führen zu dem HHT-Krankheitsbild. HHT-Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für zerebrale arteriovenöse Fehlbildungen (CAVM = cerebral arteriovenous malformation). 10% der HHT-Patienten mit einer Mutation in Endoglin und 3% der Patienten mit einer Mutation in dem ALK1 Gen sind von CAVMs betroffen. Die für HHT typische Umbildung der Gefäßstruktur lässt vermuten, dass dieser Krankheit eine fehlerhafte Zell-Zell Adhäsion und/oder Zell-Extrazelluläre Matrix Interaktion zugrunde liegt. ALK1 gehört zur Gruppe der TGF-b Typ I Rezeptoren, welche die Signaltransduktion vermitteln und ist ein Rezeptor für TGF-b 1, -b 3 und einen bisher nicht isolierten Serumfaktor. Endoglin ist ein TGF-b Typ III Rezeptor und bindet TGF-b 1, TGF-b 3, Aktivin, BMP2 und BMP7. Endoglin bildet heteromere Komplexe mit den signaltransduzierenden Typ I Rezeptoren ALK1, 2, 3, 4, 5 und ALK6. Endoglin und insbesondere ALK1 sind primär in Endothelzellen exprimiert und sind an der Angiogenese beteiligt. Endoglin und ALK1 "knock out" Mäuse sterben aufgrund vaskulärer Defekte im Embryonalstadium. Weiterhin gibt es mehrere Berichte, die zeigen, daß Endoglin eine wichtige Rolle in der Tumorangiogenese spielt. Mutationen in Endoglin können zu Haploinsuffizienz oder zu einem dominant-negativen Mechanismus führen, je nach Art der Mutation. Endoglin inhibiert unter anderem die TGF-b Signaltransduktion. Bisher ist nicht geklärt, ob Mutationen in Endoglin zu einer gestörten TGF-b Signaltransduktion führen. Kürzlich haben wir ein ALK1 interagierendes Protein (ABP-RF1) identifiziert, welches sowohl die ALK1 Signalaktivität negativ beeinflusst, als auch die Zellmorphologie in Kooperation mit ALK1 [Lux et al., Manuskript eingereicht]. Aufgrund von Two-Hybrid Daten konnten wir zeigen, dass ABP-RF1 spezifisch mit dem TGF-b Signaltransmitter Smad2 interagiert. Weiter konnten wir im Two-Hybrid System die Interaktion zwischen ALK1 und dem "focal adhesion point" und Zytoskelett bindendem Protein Zyxin demonstrieren. Das klinische Erscheinungsbild von HHT ist sehr heterogen, so dass die Diagnose schwierig ist und zumeist nur durch die genetische Stammbaumanalyse einer betroffenen Familie unterstützt wird. Für die wenigsten Patienten wurde bisher auf DNA-Ebene die zur Krankheit führende Mutation bestimmt. Zusätzlich werden Personen, die von einer de novo Mutation betroffen sind, möglicherweise nicht als Morbus Osler Patienten erkannt. Derzeit gibt es keine definitive Behandlung, jedoch einige präventive und begleitende Maßnahmen. Voraussetzung hierfür jedoch ist eine eindeutige und/oder frühzeitige Diagnose, bevor erste Symptome auftreten. Ein solcher Diagnose-Test existiert nicht. Eine klares, auf molekularbiologischen Methoden (genetisch oder biochemisch) basierendes Diagnosesystem, wie z.B. ein für Endoglin und ALK1 hochspezifischer DNA-Microarray, würde die frühzeitige Krankheitserkennung und –prävention ermöglichen sowie Genotyp/Phänotyp Korrelationen und Therapieentscheidungen präzisieren.
	Identifizierung und Validierung von Targets für die Entwicklung neuartiger Therapieansätze in der gastrointestinalen Karzinogenese entwickelt am Beispiel des EGF-Rezeptors Prof. Dr. P. Bastiaens, Cell Biology and Cell Biophysics Programme, EMBL Heidelberg, Dr. M. Keese, Chirurgische Klinik, Universitätsklinikum Mannheim Mit ca. 2,5 Millionen neuer Krankheitsfälle und fast 2 Millionen Todesfällen pro Jahr sind die Karzinome des Gastrointestinal (GI) - Traktes mit die häufigsten Krebsarten. In Anbetracht der häufigen Therapieversager (Non- und Low-responder) bei einer adjuvanten Chemotherapie von GI-Karzinomen wird es deshalb in der Zukunft von äußerster Wichtigkeit sein, selektive tumorspezifische Inhibitoren für differentiell aktivierte Signalkaskaden zu entwickeln. Dies würde eine individuelle, angepasste Chemotherapie noch während oder unmittelbar nach der operativen oder bioptischen Entnahme von Gewebeproben, also völlig neuartige Therapieansätze, ermöglichen. Eine Selektion der verschiedenen Therapieoptionen und Verlaufskontrollen (insbesondere bei Chemoresistenz und Escapephänomenen der Tumore) wird somit möglich. Aufbauend auf volle-Länge cDNAs, die im Deutschen cDNA Konsortium identifiziert und charakterisiert wurden, sollen experimentell Proteine identifiziert werden, die im Verlauf der stimulierten Zellproliferation oder Apoptose an Tyrosin-Resten phosphoryliert werden, mit dem Ziel, Mitglieder von regulierenden Signalkaskaden als potentielle Targets für die Diagnose und Therapie zu identifizieren. Die auf den volle-Länge cDNAs kodierten Proteine sollen in Zellen exprimiert und mittels GFP-Fluoreszenz lokalisiert werden. Bereits über 150 cDNAs wurden an GFP gekoppelt und konnten in Zellen lokalisiert werden. Die dabei entwickelten Verfahren ermöglichen es, die ca. 1,000 bisher unbekannten und vollständig sequenzierten cDNAs, die als Klone bei DKFZ-MGA zur Verfügung stehen, systematisch an GFP zu koppeln und die exprimierten GFP-Proteine in Zellen zu lokalisieren. Im Anschluss daran werden aus diesen cDNAs solche charakterisiert, die nach Wachstumsstimulierung an Tyrosinresten phosphoryliert werden. Hierzu soll ein neuartiges Verfahren benutzt werden, das in den vergangenen zwei Jahren in der Gruppe Bastiaens entwickelt wurde und sich insbesondere auch zur Validierung der gefundenen "Targets" in Tumorgewebe eignet . Das hierfür notwendige Tumormaterial wird aus der von der Gruppe Sturm verwalteten Tumorbank eingebracht, aufbereitet und unter histopathologischen Aspekten charakterisiert. In einem Kooperationsprojekt der Gruppen Bastiaens/Sturm wurde die Expression und Aktivität von EGF und die Expression des EGF-Rezeptors in humanen kolorektalen Zellinien und Tumorschnitten charakterisiert. Verwendet wurde hierbei ein Cy-3/Cy-5 Antikörperpaar, bei dem FRET nur im aktivierten Rezeptor nachweisbar ist. Zur Beobachtung der EGFR-Aktivität in vivo soll ausgehend von den Erfahrungen, die aus einer Zusammenarbeit zwischen den Gruppen Sturm/ Hafner (In-Vivo-Videomikroskopie mit EGFP transfizierten syngenen Mauskolonkarzinomzellen in der Leber, Quantifizierung des Tumorwachstums über EGFP-Quantifizierung) und Sturm/ Bastiaens (in-vivo-FLIM) gesammelt wurden, eine kolorektale Zellinie mit einem FRET-aktiven EGFR-Konstrukt transfiziert werden.
	Multifluoreszenzmikroskopische Analyse (Ionen-Imaging, FRET) der neuronalen Exzitotoxizität Prof. Dr. M. Hafner, Prof. Dr. P. Kioschis, Institut für Molekularbiologie und Zellkulturtechnik, Fachhochschule Mannheim - Hochschule für Technik und Gestaltung Die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität sind bis heute zum Teil nur spekulativ erklärbar. Eine der gängigen Hypothesen stellt die Wirkung der postsynaptischen Überstimulation von Glutamat-Rezeptoren, sowie die massive Erhöhung der intrazellulären Calciumionen-Konzentration ("Calcium-load"-Hypothese) in den Mittelpunkt des neurotoxischen Geschehens. Faktisch jeder bedeutende Calcium-abhängige Prozess (z. B. die Überstimulation von Phospholipasen, Calpainen, Proteinkinasen, neuronalen NO-Synthasen, Calcineurinen oder Endonukleasen) wurde mit einem der vielen möglichen cytodestruktiven Mechanismen in Verbindung gebracht. Ergebnisse aus unserer Arbeitsgruppe in Kooperation mit Tymianski (Univ. Toronto) weisen daraufhin, dass die akute Calcium-Neurotoxizität eher durch spezifisch definierbare Signaltransduktionswege ausgelöst wird, als durch eine generelle Überaktivierung vieler Calcium-abhängiger Prozesse ("source specificity" Hypothese). Es wurde gefolgert, dass der entscheidende Parameter für das Ausmaß der Exzitotoxizität nicht der generelle Zusammenbruch der zellulären Calcium-Homöostase aufgrund eines übermässigen Calcium-Einstroms ist, sondern vielmehr die lokale Aktivierung calciotroper NMDA-Rezeptoren und mit diesen assoziierte Effektorsysteme im Bereich der post synaptic density (PSD). Weitere Daten legen die Vermutung nahe, dass dabei dem multimolekularen Komplex, bestehend aus NMDA-Rezeptor, PSD-95-Protein und nNOS, eine besondere Bedeutung zukommt. Mit multiparametrischer Fluoreszenzmikroskopie (NO, Calcium, mitochondriales Membranpotential) soll jetzt die Quellenspezifität der NO-Freisetzung und die damit verbundene Aktivierung der Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) (in Kooperation mit Prof. Schilling, Mannheim und Prof. Bürkle, Universität Konstanz) untersucht werden. Seit kurzem wird auch bei der autosomal dominant vererbten Huntington Chorea eine Beteiligung des NMDA-Rezeptors und der assoziierten PSD am zell-spezifischen exzitotoxischen Zelltod diskutiert. Wir haben daher eine Kooperation mit E. Wanker (MDC, Berlin) begonnen, um mit neuen fluoreszenzoptischen Imaging-Verfahren (Fluoreszenz-Resonanzenergie-Transfer = (FRET)-Mikroskopie) die Assoziation von Huntingtin und Huntingtin-bindenden Proteinen u. a. an PSD-Proteinen (z. B. PSD-95) nachzuweisen. Das Huntingtin-Gen enthält einen variablen Bereich aus CAG-repeats. Durch den Einbau einer zu langen Abfolge von Glutaminresten in das Huntingtin-Protein kommt es zu einer Umwandlung in eine Amyloidstruktur, die zur selektiven Zerstörung von Neuronen in der Cortex und in Stammganglien führt. Es besteht ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Anzahl der CAG-repeats und der Schwere der Krankheit. Bisher wurde die FRET-Mikroskopie etabliert und in Zusammenarbeit mit der Fa. Carl Zeiss Vision GmbH (Dr. Malkusch) eine Software zur Datenaufnahme und –auswertung entwickelt. Ferner wurden GFP-Fusionsproteine von Huntingtin und HIP1 (Huntingtin interacting protein 1) hergestellt und in CHO-K1 Zellen coexprimiert
	Intravitale Fluoreszenzdetektion zur Charakterisierung der VEGF-vermittelten Extravasation am Modell der cerebralen Ischämie: Vergleich mit experimentellen Glioblastomen Prof. Dr. Dr. L. Schilling, Dr. P. Vajkoczy, Neurochirurgische Klinik und Forschung, Fakultät für Klinische Medizin der Universität Heidelberg, Universitätsklinikum Mannheim Das Glioblastom gehört zu den bösartigsten Tumoren, deren Überlebenszeit nach Stellen der Diagnose im Mittel bei 9 Monaten liegt. Diese schlechte Prognose hat sich trotz der Fortschritte auf den Gebieten der Mikrochirurgie, der Bestrahlungstherapie und der Chemotherapie in den vergangenen Jahren nicht wesentlich verändert. Daher sind weitere grundlegende Untersuchungen zur Biologie dieser Tumore notwendig als Grundlage zur Entwicklung neuer Behandlungskonzepte, deren Angriffspunkt die Tumorzellen selbst (deren Wachstum und/oder Dissemination) oder das versorgende Gefäßsystem (z.B. Hemmung der Tumor-induzierten Angiogenese) sein können. Da Glioblastome zu den hoch vaskularisierten soliden Tumoren zählen, sind anti-angiogenetische Therapiestrategien von besonderem Interesse. In der Tumorangiogenese nimmt der ‘vascular endothelial growth factor‘ (VEGF), der neben der Angiogenese auch die Gefäßspermeabilität verändert, eine Schlüsselrolle ein. Darüber hinaus erfüllt VEGF auch die wesentlichen Kriterien eines Hirnödem-auslösenden Mediators (Schilling und Wahl, 1999) und scheint in der pathophysiologischen Kaskade nach cerebraler Ischämie und nach Schädel-Hirntrauma wesentlich beteiligt zu sein. Dabei steht in der Frühphase wohl eher der permeabilitätssteigernde Effekt im Vordergrund, während der angiogenetische Aspekt erst später an funktioneller Bedeutung gewinnt. Bislang sind 3 Rezeptortypen beschrieben, die die biologischen Wirkungen des VEGF vermitteln: der VEGFR1 (flt-1 Rezeptor), der VEGFR2 (flk-1/KDR-Rezeptor) und der VEGFR3. Diese sind Rezeptor-Tyrosinkinasen mit 7 extrazelluären IgG-ähnlichen Domänen und einer transmembranalen Region. Unter diesen kommt dem flk-1/KDR-Rezeptor die größte Bedeutung zu bei der Induktion der Angiogenese. Dagegen scheint die Vermittlung einer Permeabilitätszunahme zumindest partiell über andere Mechanismen abzulaufen, wobei derzeit gute Evidenz für die Beteiligung von Rezeptor-unabhängigen src-Kinasen besteht (Paul et al., 2001). Für die Untersuchungen der Mikrozirkulation in verschiedenen Organen haben intravitalmikroskopische Verfahren in Verbindung mit fluoreszenzmikroskopischen Methoden sowohl zur Darstellung des Intravasalraums als auch der Durchlässigkeit der Gefäßwand große Bedeutung. Unter den Tracern ist das Fluorescein als kleinmolekulare Substanz (Molekulargewicht: 376 Da) oder gekoppelt an Makromoleküle wie Albumin oder Dextrane unterschiedlicher Größe weit verbreitet. Neben diesem ‘Klassiker‘ stehen seit einigen Jahren weitere Tracer mit guter Fluoreszenzausbeute zur Verfügung, deren Anregungs- und Emissionspektren von denen des Fluorescein verschieden sind (z.B. Rhodamin, CY3 und CY5). Durch die Benutzung unterschiedlich großer Tracer und/ oder eine geeignete Kombination mehrerer Tracer können verschiedene Aspekte einer Fragestellung, u.U. sogar simultan mittels Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden (Schilling und Wahl, 1994; Vajkoczy et al., 1998, 1999, 2002). Neben den o.g. exogenen Tracern (das sind Tracer, die systemisch injiziert werden müssen) hat ein endogener Tracer (d.i. ein Tracer, der von Zellen selbst synthetisiert wird) in den vergangenen Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen: das sog. ‘green fluorescent protein‘ (GFP). Dieses Protein, das aus der Tiefseequalle Aequoria victoria isoliert wurde, wird nach erfolgreicher Klonierung in eukaryontische Systeme häufig als Reporterprotein eingesetzt. Der Nachweis der Proteinexpression kann direkt fluoreszenzmikroskopisch in-vivo erfolgen und immunhistochemisch ex-vivo weitergeführt werden. In früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe wurde das GFP benutzt, um die Wachstumscharakteristik von transfizierten C6-Gliomzellen und anderen Tumorzell-Linien in vitro und in vivo zu beschreiben. In dem hier beschriebenen Projekt soll GFP benutzt werden, Tumorzellen nach Injektion ins Hirngewebe zu lokalisieren und die Extravasationskinetik exogener Tracer in Abhängigkeit von der Tumorgröße zu bestimmen.
	Gentherapie bei Zystennieren unter Nutzung bildgebender Verfahren Prof. Dr. N. Gretz, Dr. S. Hoffmann, Zentrum für Medizinische Forschung, Fakultät für Klinische Medizin der Universität Heidelberg, Universitätsklinikum Mannheim Zystennieren haben eine Prävalenz von etwa 1:1000 und führen bei 50% der Betroffenen im Alter zwischen 50 und 60 Jahren zu einer terminalen Niereninsuffizienz. Bisher sind zwei Gene bekannt (PKD1, PKD2), die bei dieser Erkrankung mutiert sind. Neben der unterschiedlichen Penetranz weist die Erkrankung auch einen geschlechtsspezifischen Verlauf auf, wobei Frauen in der Regel ca. 6-7 Jahre später terminal niereninsuffizient werden als Männer. Eine kausale Therapie für diese Erkrankung gibt es bisher nicht. Bei der Erkrankung, völlig unabhängig durch welchen genetischen Defekt bedingt, kommt es zu einer zystischen Umwandlung der Nierenstrukturen mit nachfolgender interstitieller Fibrose und progredientem Nierenfunktionsverlust. Der individuell sehr unterschiedliche Krankheitsverlauf lässt das Vorhandensein sogenannter "Modifier Gene" vermuten. So konnte kürzlich nachgewiesen werden, dass eNOS ein solcher "Modifier" bei Menschen darstellt . Bei der Maus konnten verschiedene Loci identifiziert werden, die mit Veränderungen in der Progression in Verbindung gebracht werden . Kürzlich konnten wir nachweisen, dass auch bei einem Rattenstamm: PKD/Mhm, mit autosomal dominant vererbten Zystennieren ein "Modifier Gen" auf Chromosom 8 lokalisiert ist . Als Kandidatengene für die Modifikation der Progression bieten sich Metalloproteinasen / Metalloproteinaseinhibitoren an. So konnten wir kürzlich nachweisen, dass der Metalloproteinaseinhibitor Batimastat das Zystenwachstum deutlich beeinflusst. In einem teilweise EU- und Industrie-geförderten Projekt entwickeln wir gentherapeutische Methoden zur Begrenzung der Zystenprogression. Bisher gibt es noch kein Verfahren, unter in vivo Bedingungen die Verteilung des applizierten Transgens zu lokalisieren sowie das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des Transgens in vivo zu erfassen. Diese Informationen sind jedoch notwendig, um Dosis, Applikationsmodus und Vektor optimieren zu können. Mittels bildgebender Verfahren soll unter in vivo Bedingungen der Weg des Transgens vom Zeitpunkt der Injektion über die Proteinexpression bis hin zu phänotypischen Veränderungen im Ganztier analysiert werden. Ziel unserer Arbeitsgruppe ist es somit, einerseits mittels "Modifier Genes" den Verlauf der Erkrankung zu beeinflussen, andererseits aber auch die Mechanismen der Transgen/Phänotyp Relation auf den Ebenen des Transkriptoms, Proteoms und letztendlich der morphologischen und pathophysiologischer Konsequenzen im Kontext des Gesamtorganismus zu untersuchen. Neben in vivo Untersuchungen werden hierzu auch in situ Hybridisierungen, Chiptechnologien sowie immunohistologische Methoden eingesetzt. Um die in vivo Bewertung der Nierenfunktion zu optimieren, sollen neue Marker entwickelt werden. Die gentherapeutischen Applikationsmethoden sollen zunächst bei der Ratte etabliert und dann auch auf die Maus übertragen werden, um sie für knock-out Linien applizierbar zu machen.
	Bildanalyse und statistische Analyse von funktionellen Genexpressionsdaten Dr. R. Eils, Intelligent Bioinformatics Systems Group, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg Zur Untersuchung der "Funktionellen Expressionsanalyse" werden molekularbiologische und biophotonische Verfahren eingesetzt, um biologische Prozesse auf molekularer oder zellulärer Ebene mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung quantitativ abzubilden. Die funktionelle Expressionsanalyse umfasst die zellfreie und die zellbasierte Untersuchung von Genalterationen, Genaktivitäten, und Genexpressionsmustern sowie von Proteinaktivitäten im Rahmen der intrazellulären Signaltransduktion. Die hier mittels bildgebender Verfahren produzierten Daten sind äußerst komplex. Während bei der Chip-basierten Genexpressionsanalyse typischerweise Bilddaten für mehrere zehntausend Spots für jedes untersuchtes Material anfallen, sind bei der zellbasierten Analyse die räumliche und auch zeitliche Information maßgebliche Dimensionen in der Analyse. Die Abteilung Eils (DKFZ) arbeitet an der Entwicklung von Technologien in der Bioinformatik und der computergestützten Biologie zur Interpretation komplexer Daten, die durch bildgebende Verfahren in der zellfreien und zellbasierten Expressionsanalyse entstehen. Vorrangig handelt es sich um wissensgestütztes Data-Mining chipbasierter Expressionsdaten (z.B. Berrar et al. 2001; Granzow et al. 2001; Schoch et al. 2002) und automatisierte Methoden zur Interpretation zellbasierter Genexpressionsdaten (Gerlich et al. 2001, Beaudouin et al. 2001). Dazu existieren mehrere patentierte Softwaresysteme für wissensgestütztes "Data-Mining" der automatischen Klassifikation von Proteinen aufgrund des zellulären Verteilungsmusters und der zeitaufgelösten Bildanalyse dynamischer Prozesse im Zellkern. Die Analyse räumlicher Strukturen erfordert dreidimensionale Bildverarbeitungstechniken (Eils et al. 1996; Eils und Sätzler 1998). Unter Hinzunahme der Zeit sowie der Farbinformation als weitere Parameter ergibt sich ein fünfdimensionales Bildverarbeitungsproblem (Tvarusko et al. 1999). Im Graduiertenkolleg sollen daher in enger Zusammenarbeit mit den Gruppen Cremer, Rippe und Bastiaens Techniken der multidimensionalen Objektdetektion, Bildfolgen- und Vielfarbenbildverarbeitung sowie der computergraphischen Visualisierung zur Analyse der räumlichen und zeitlichen Genexpression in vivo entwickelt werden. Diese Systeme können dann in den anwendungsbezogenen Gruppen (Gretz, Hafner, Kioschis, Lichter u.a.) zum Einsatz gebracht werden. Zur Analyse chipbasierter Genexpressionsdaten müssen rigorose Merkmalsselektionen durchgeführt werden, um das ungünstige Verhältnis zwischen der großen Parameterzahl (ca. 10⁵) und der kleinen Fallzahl (typischerweise ca. 10²) zu verändern. Hierbei verfolgen wir Strategien aus der Informationstechnologie (Ragg et al. 2001), mit deren Hilfe wir den relativen Informationsgehalt einer Eingabevariable (z.B. den Expressionswert eines einzelnen Gens oder einer Gruppe von Genen) auf die Zielgröße (z.B. den Phänotyp) bestimmen können. Anhand dieses Informationsgehalts kann ein Ranking über die Variabeln durchgeführt werden, das zu einer kleinen Auswahl informatiosntragender Parameter führt, die in den statistischen Lernprozess einfließen. Zur Trainierung eines Klassifikationsmodells benutzen wir Methoden des maschinellen Lernens (z.B. Künstliche Neuronale Netze, Entscheidungsbäume und Support Vector Maschinen). Die beschriebene Technologie haben wir in mehreren Anwendungsfällen zur Klassifikation von Untergruppen verschiedener Krebsarten mittels der chipbasierten Genexpressionsanalyse eingesetzt (Schoch et al. 2002, Fritz et al. 2002).

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Verantwortlich: Prof. Dr. N. Gretz