Sie befinden sich hier

Inhalt

Häufig gestellte Fragen

Wie gehe ich vor, wenn ich Zellen sortieren will?

Einfach per Mail oder Telefon Kontakt zu uns aufnehmen. Bei einfachen Sortierexperimenten reicht ein Telefongespräch aus, manchmal ist aber ein persönliches Treffen vor dem ersten Sort sinnvoll, damit alle Voraussetzungen geklärt werden können.

Wie funktioniert eine Terminabsprache?

Folgendes muss bekannt sein, um eine sinnvolle Zeitberechnung für den Sort vorzugeben.

  • Zellart
  • Zellzahl
  • alle verwendeten Fluorochrome
  • Populationsdefinitionen und -dichte

Was muss ich zum Sortieren mitbringen?

Filtrierte Zellen, die sortiert werden sollen, die erforderlichen Kontrollen, Auffanggefäße und beim ersten Sort auf jeden Fall ein bisschen mehr Zeit.

Wie viele Zellen muss ich zum Sortieren bringen?

Die am häufigsten gestellte Frage. Um diese zu beantworten, werden folgende Informationen benötigt:

  1. Wie groß ist die zu sortierende Population (~ Prozentangabe)?
  2. Wie viele Zellen sollen nach dem Sort erhalten werden?
  3. Was ist wichtiger hohe Reinheit oder Ausbeute?
  4. Wie fragil oder groß sind die Zellen?

Die Dauer des Sortiervorgangs wird von all diesen Parametern beeinflusst. Hierfür ein kleines Beispiel: Eine 20%ige Subpopulation soll sortiert werden und für das nachfolgende Experiment werden 2 Millionen Zellen benötigt. Theoretisch muss man 10 Millionen Zellen durch den Sorter laufen lassen (20% von 10 Mio. = 2 Mio.). Aber die tatsächliche Ausbeute liegt bei 75-95% des theoretischen Wertes. Ein Grund hierfür sind die Abbruchraten, die durch Sortierkonflikte verursacht werden. Doch der größte Faktor stellt die Qualität der zur sortierenden Zellen dar. Die Zellen müssen als klumpenfreie Einzelzellsuspension gebracht werden, um gute Sortierergebnisse, wie Reinheit und Ausbeute, zu erhalten. Deshalb sollten 25-50% mehr Zellen als der theoretische Wert zum Sorter gebracht werden.

Wie lange dauert der Sort?

Die Antwort ist vor allem abhängig von der Zielstellung des Sorts (Ausbeute vs Reinheit), von den Charakteristika der Zellen (fragile und große Zellen benötigen niedrigeren Druck und Geschwindigkeit mit einer größeren Düse) und der Konzentration der Zellen (der Sort dauert umso länger, desto verdünnter die Zellen sind).

Beispiele für maximale Eventraten:

  • Primäre Lymphozyten mit 70 µm Düse und 70psi: 20.000/sek
  • Primäre Lymphozyten mit 70 µm Düse und 35psi: 10.000/sek
  • Primäre Lymphozyten mit 100 µm Düse und 20psi: 6000/sek

Für Zelllinien hängt die Flussrate von der Größe der Zellen ab. Bei einer Geschwindigkeit von 10.000/sek bräuchte man zirka 30 Minuten um insgesamt 18 Millionen Zellen durch den Sorter zu jagen. Mit dem oberen Beispiel ergibt sich in theoretische Ausbeute von 18 Mio. x 20% = 3,6 Mio. Werden hohe Ansprüche an die Reinheit gestellt oder die Zellen sind von schlechter Qualität (niedrige Vitalität, Verklumpungen, usw.) wird die tatsächliche Ausbeute beedeutend geringer sein.

Was muss noch bei der Zellvorbereitung beachtet werden?

Die Zellen müssen gefiltert werden, am besten direkt vor dem Sort mit einem 30 µm oder 50 µm Zellsieb. Die Zellsiebe können von der FlowCore bereitgestellt werden.

Wie müssen die Zellen für den Sort resuspendiert werden?

Die Zellen sollen in einer Konzentration von 20-30 Mio. (primäre Zellen) oder 5-10 Mio. (Zelllinien) pro Milliliter in Puffer resuspendiert werden. Bei Unsicherheiten Zellen lieber ein wenig zu konzentriert mitbringen, denn diese können nachträglich noch verdünnt werden. Eine optimale Zellpräparation erhöht nicht nur die Vitalität, sondern führt auch zu einer besseren Ausbeute.

Welcher Puffer sollte zum Sortieren verwendet werden?

Als Puffer können Calcium und Magnesium freies PBS oder HBSS verwendet werden(nach Absprache auch andere). Der Zusatz von 10 mM Hepes, pH 7,2 wird empfohlen, um den pH Shift durch den höheren Druck im Sorter abzupuffern. Viele Zellen rofitieren außerdem von Proteinen im Puffer wie z.B. 2% FCS oder BSA. Aber Vorsicht, eine Serumkonzentration über 5% kann zu Zellaggregation und Verstopfung des Gerätes führen. Für Zelllinien und adhärente Zellen wird der Zusatz von 0,5 mM EDTA empfohlen. Bei Zellen, die „sticky“ sind kann sinnvoll sein, die EDTA Konzentration auf 5mM anzuheben. Bei Zellsuspension mit einem hohen Anteil an toten Zellen, kann die freigesetzte gelöste DNA, die Zellen überziehen und so zu schwerwiegenden Verklumpungen der Zellen führen. Dagegen hilft der Zusatz von 10U/mL DNAse II zum Sortierpuffer.

In welchen Röhrchen kann man die Zellen zum Sortieren bringen?

Am besten geeignet sind dafür sterile 15 mL Röhrchen oder sterile 5 mL FACS Röhrchen. Sterile FACS Röhrchen können von der Cell Sorting Core Facility bereitgestellt werden.

Wie sollen die Zellen gebracht werden?

Am besten auf Eis und lichtgeschützt.

Welche Kontrollen müssen mitgebracht werden?

Folgende Kontrollen werden bei einem durchflusszytometrischen Experimentes empfohlen.

  • Ungefärbte Zellen als negative Kontrolle
  • Unstimulierte/unbehandelte Zellen als biologische Kontrolle
  • Einzel gefärbte Zellen oder Beads als Kompensationsröhrchen
  • FMO (Fluoreszenz Minus One) und Vitalität als Gating Kontrolle

In welche Gefäße kann sortiert werden?

Um hohen Zellverlusten vorzubeugen, sollten die Zellen in Röhrchen aus Polyethylen oder in beschichtete Röhrchen (z.B. BSA oder FCS; dieses verhindert die Anlagerung der Zellen an die Plastikwand) sortiert werden. Am Besten wird in die Röhrchen 3 mL Puffer oder Medium vorgelegt. Für große Zellpopulationen werden 15 mL Röhrchen empfohlen, hierbei können allerdings nur zwei Populationen gleichzeitig sortiert werden. Bei 5 mL FACS Röhrchen können vier Populationen gleichzeitig sortiert werden. Außerdem kann bei geringen Zellzahlen auch direkt in Mikrotiterplatten (96- bis 6-Well Platten) sortiert werden.

Welche Fluorochrome können gemessen werden?

Vor allem bei fluoreszierenden Proteinen muss abgeklärt werden, ob diese auch am Durchflusszytometer gemessen werden können. Nicht jede Fluoreszenz, die am Mikroskop dargestellt werden kann, kann auch im Durchflusszytometer gemessen werden! Dieses muss im Vorfeld abgeklärt werden. Die Leistungsmerkmale der Durchflusszytometer der Core Facility können nachgelesen werden und mit der Extinktion und Emission der jeweiligen Fluorochrome abgeglichen werden. Eine Unterstützung hierfür können im Internet verfügbare Spectrum Viewer sein. Diese werden von verschiedenen Firmen angeboten.

Welche Vorbereitungen müssen sonst noch getroffen werden?

Bevor die Zellen sortiert werden, müssen die Zellen schon charakterisiert worden sein (fluoreszenzmikroskopisch oder durchflusszytometrisch), die Ausdrucke müssen beim ersten Mal mitgebracht werden.
Antragsformular ausfüllen und mitbringen. Pünktlich erscheinen!

Ist der Sort steril?

Der Sort wird so steril wie möglich (aseptisch) durchgeführt. Die Sterilität des Sorters wird in regelmäßigen Abständen kontrolliert. Die Zugabe von Antibiotika zum Medium nach dem Sort wird dennoch empfohlen.

Kontextspalte